Famille de formation

Le LNC souhaite renforcer et faire reconnaître les compétences de son unité de biologie moléculaire dans la recherche de pathogènes par PCR.
La formation vise à accompagner l’accréditation de la méthode de diagnostic de l’influenza A selon les référentiels NF 17025 et NF U47-600.

1) Pratiques et attentes des participants

2) Introduction à la méthode PCR (et à la normalisation) :

• Les acides nucléiques
• Préparation des échantillons
• Extraction purification des acides nucléiques (phénol/chloroforme), colonnes de silice, billes magnétiques
• Thermocyclage
• Différentes étapes de la PCR
• Notions de PCR Digitale
• Pourquoi et comment normaliser ?

3) Norme 47600-2  Exigences et Recommandations pour le Développement de la PCR en Santé Animale 

• Caractérisation de la PCR (qualitative, quantitative, relative) : analyse in silico, spécificité et sensibilité analytique, limite de détection, limite de quantification, linéarité, efficacité
• Caractérisation de la méthode (qualitative, quantitative, relative) : spécificité et sensibilité diagnostique, limite de détection méthode, justesse, fidélité, limite de quantification méthode
• Problématique des matrices analytiques et des matrices des matériaux de référence
• Problématique des estimations de sensibilité et de spécificité diagnostique
• Problématique des valeurs prédictives positives et négatives
• Modalités de caractérisation de la limite de détection méthode
• Modalités de caractérisation de la limite de quantification méthode (profil d’exactitude)
• Modalités de caractérisation de la fidélité d’une PCR relative
• Modalités de validation d’une méthode d’analyse PCR
• Exemple de mise en application : examen de dossiers de caractérisation émis par un laboratoire développeur et/ou un fournisseur de trousse PCR.
• Veille épidémiologique

4) Norme 47600-1  Exigences et Recommandations pour la mise en œuvre de la PCR en Santé Animale 

• Principes généraux d’adoption de méthode PCR : approbation du dossier de validation, confirmation de la capacité de mise en œuvre, méthodes reconnues, réactifs agréés
• Modalités d’adoption de méthode qualitative (3 LD PCR et fidélité à 10 LD méthode), quantitative (LQ PCR, LD méthode), relative (fidélité de la méthode au seuil d’interprétation).
• Exemple de mise en application : examen de dossiers de validation réalisés par le laboratoire à partir de caractérisation de méthode réalisée ou non dans le laboratoire
• Modalités de mise en œuvre des méthodes PCR dans la laboratoire : échantillons pour laboratoire, série pour analyse, témoins positifs et négatifs, lecture et validation des signaux PCR, cartes de contrôle et estimation de l’incertitude en valeur de Ct pour une méthode qualitative, modification des conditions opératoires (modification d’une méthode validée, combinaison de méthodes validées, concordance de résultats), vérification du maintien des performances, réactifs et consommables critiques, locaux, personnels, métrologie, modalités de rendu des résultats, exemples de difficultés concrètes d’application.

5) Réflexions sur la métrologie des thermocycleurs

• Philosophie de la norme PCR en santé animale : associer vérifications métrologiques ET vérification des performances,
• Gestion des cycles de température (historique, principes de fonctionnement d’un thermocycleur, modalités d’interprétation métrologique des profils thermiques),
• Gestion des différents systèmes optiques de thermocycleurs, spectres d’émission et d’absorption, incidence du logiciel et de son réglage sur les courbes de fluorescence).

6) Gestion de la portée d’accréditation

• Expression et évaluation des portées d’accréditation (LAB REF 08), pratiques habituelles du Cofrac en PCR santé animale, exemples de portées en PCR.